来 源：刘 惠，宋 娇，林俊芝，苏 娟，柯秀梅，仇 敏，杨 明，张定堃．中药苦味身分的创造策略与方法研究进展 [J]. 中草药, 2024, 55(5): 1751-1760.
中药苦味身分来源广泛，构造多样，呈味特色繁芜。如何精准创造与辨识中药苦味身分，是推动中药抑苦掩味技能精准化发展的主要条件。经由多年的当代研究，部分临床常用苦味中药的紧张呈味物质已相对清晰，基本摆脱了“黑箱”状态。如黄连的紧张苦味身分是小檗碱、表小檗碱、药根碱等生物碱类[1]；穿心莲的紧张苦味身分是穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯等萜类[2]；鸡内金的紧张苦味身分是L型苦味氨基酸等[3]。
然而，由于中药苦味身分的靶向分离面临技能瓶颈，导致很多中药的苦味身分仍有待阐明，整体研究尚处于“灰箱”状态。详细表现在以下2个方面。
（1）挖掘苦味身分的导向性不足：中药苦味身分种类多，包括生物碱、黄酮、萜类、氨基酸、无机盐及杂醇等大类身分，部分药物可能同时含有多类苦味身分，导致传统苦味身分分离方法缺少导向性。同时，各种苦味身分的理化性子并不完备相同，分离过程随意马虎涌现苦味部位分散的环境，增加苦味身分示踪难度。
（2）苦味验证的还原性不敷：中药的苦味呈现每每是多种同系物、同分异构体等化合物的苦味叠加，身分浓度、身分种类对口感影响大。此外，药物中的酸味身分会增强苦味的感知、咸味身分会抑制苦味的感知[4]，这些影响成分使得苦味身分在单一状态下与在中药繁芜体系下的呈味特色存在差异。
基于此，本文通过对中药苦味身分的创造方法进行总结，并进一步提出辨识中药苦味身分的新方法、研究苦味身分的新思路，推动中药苦味身分化析方法的传承创新，为深入理解中药苦味身分的构造特色与呈味规律，科学订定抑苦掩味技能方案供应支撑。
1 基于本草学知识创造苦味身分1.1 基于中药性能特色创造苦味身分中药传统药性理论中的“五味”理论，记载了药物的酸、苦、甘、辛、咸5种药味。个中，苦味的性能特点为能泄、能燥，功效表现为清热泻火、通泄大便、燥湿坚阴等，多集中于清热药、泻下药等。但长久以来，传统本草文献中对付药物性能药味的记载与真实滋味的记载殽杂，部分药物作为性能的五味与真实滋味相同，如黄连、苦参等。
也有部分药物作为性能的五味与真实滋味并不完备同等，如鸡内金药性为甘味，突出其健胃消食功效，但其真实滋味又为微苦味。文献记载的药性“五味”与口尝滋味的殽杂，为药性理论研究带来了困惑，但也为药物真实滋味的研究供应了线索。对付一些临床利用频率较低、药味研究较薄弱的中药或民族药，可通过文献药性记载或功效特点初步判断其真实滋味，继而探求苦味身分。胡亚楠[5]建立了苦味性、效生物网络，从当代科学的角度阐释真实苦味和性能苦味干系靶点的同等性，探究苦味中药与清热解毒生物靶点间的关联程度，提示可遵照该线索创造中药的苦味身分。
1.2 基于苦味植物来源创造苦味身分药用植物亲缘学在探求替代药源、开拓植物新类群中具有主要的辅导浸染[6]，为挖掘苦味新身分和开拓中药苦味新运用拓展了思路。研究苦味中药的植物来源，紧张分布于菊科、芸喷鼻香科、百合科、豆科、唇形科、伞形科、五加科（图1）等，苦味身分广泛分布的类群可能蕴含更多的潜在苦味身分。在植物分类学中，亲缘相同或附近的物种表现出相似的外不雅观性状，可能蕴含相似的生物学信息，遗传规律下可能具有相同或附近的次生代谢产物合成路子，因此含有某些相同身分的几率更大。
以人参为例，苦味紧张来源于人参皂苷类身分，其同科同属近种的泰西参与三七也具有类似的苦味、含有相同的人参皂苷类身分。此外，三七中人参皂苷含量显著高于人参、泰西参，因此，三七的苦味更为强烈。挖掘苦味身分时，从中药植物亲缘性出发，可为判别苦味来源缩小筛选范围、减少研究的盲目性，即优先选择与已知苦味中药亲缘附近的物种作为苦味研究的工具。
2 苦味身分的分离与剖析方法2.1苦味部位的逐步分离与精制
采取分离技能将苦味身分从中药中逐步分离、浓集，是研究苦味身分的关键。系统分离法结合大孔吸附树脂分离是得到苦味身分集中部位的常用方法。根据苦味身分的化学构造特色，大多数苦味身分都有一定疏水性或疏水构造[7]，紧张存在于中低极性溶剂部位。根据“相似相溶”事理，系统溶剂分离法[8]可得到相应溶剂的提取部位。相较于离子交流色谱多运用于分离具有离子官能团的身分，凝胶滤过色谱紧张用于分离存在相对分子质量差异的身分，大孔树脂吸附分离法运用范围更广泛，更适用于各种天然产物的分离纯化[9]，通过对初分离得到的苦味身分群进行吸附和洗脱，可实现苦味身分的进一步精制、富集。由于不同树脂型号对不同化合物吸附能力不同，根据潜在苦味身分的构造特色选择得当的树脂型号，可达到更好的分离效果。
2.2 当代剖析方法鉴定苦味身分结合感官导向的当代剖析技能是研究中药苦味身分的主要手段，有助于提高创造苦味身分的效率。Pickrahn等[10]通过二维液相色谱结合滋味稀释剖析方法，从茴喷鼻香提取物的256种组分中识别到苦味阈值最低的身分2-甲基丁酸反式假异戊烯醇，当代剖析方法与感官导向方法有助于从繁芜滋味身分中快速筛选关键苦味身分。超高效液相色谱联合翱翔韶光串联质谱是当代运用最广的剖析技能之一[11]，能实现中药组分的识别与鉴定。Yu等[12]在感官勾引下借助高效液相色谱串联质谱鉴定出杭白芷中的水合氧化前胡素、佛手柑内酯、花椒毒酚、欧前胡素、异茴芹内酯和氧化前胡素6种苦味身分。Ke等[13]通过溶剂萃取、色谱分离、感官剖析、超高效液相色谱翱翔韶光质谱鉴定等多种剖析方法的联用，从花椒等分离出了7-甲氧基喷鼻香豆素和8-异戊烯基山柰酚2种苦味身分。
2.3主客不雅观方法联用评价苦味特色药物口感评价包括感官评价等主不雅观剖析方法和动物偏好实验、电子舌评价、电生理实验等客不雅观剖析方法[14]，个中，感官评价和电子舌运用较多。感官评价是经典的苦味评价方法，利用范围最广、韶光最久、最能反响真实味觉，志愿者可准确描述药物的苦味特色及其他感官特色。但由于志愿者个体差异大，评价结果受志愿者生理、生理及环境成分的影响[15]，评价结果差异较大；此外，对付部分存在毒性、刺激性样品难以适用。
电子舌是味觉评价的主要方法，采取膜电位传感器仿照人体的味觉感想熏染器，将苦味化合物浓度旗子暗记转换为电势旗子暗记予以量化表征，具有检测灵敏、样品花费量少等优点。Zhang等[16]采取电子舌评价赞助创造穿心莲的4种关键苦味身分——穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯。但电子舌传感电极事情事理始终不同于人体真实的味觉细胞，评价结果与真实的味觉感想熏染存在一定差异[17]。感官评价与电子舌评价各有千秋，滋味研究中常日将2种方法联用以填补不敷，相互佐证实验结果，增加实验结果的可靠性。张璞等[18]以不同苦味中药水煎液为研究工具，将感官评价与电子舌评价相结合，探究了不同种类苦味身分的苦度叠加规律。
2.4 身分敲入法还原验证苦味对付分离出的单一苦味身分，其苦味特色可能与中药材或水煎液的整体苦味特色有明显差异。因此，潜在苦味身分既须要单一口感验证，也须要置于整体背景下进行验证。身分敲入法是指将潜在苦味身分按照不同浓度梯度分别加入到药液样品中，通过比较敲入前后不同组别样品的口感差异，评价潜在苦味身分对付整体口感的贡献度，探究其“含量-苦味强度”关系[19-20]。
身分敲入法[21]符合中药繁芜体系组成特色，能在整体背景下还原验证潜在身分苦味，是一种较好的验证方法。丁涌波等[22]在挖掘花椒精油苦味来源的研究中，通过减压蒸馏份离出各馏份，在感官导向下定位苦味馏份，利用气相色谱-质谱法鉴定出了花椒中芳樟醇、崖伯酮、喷鼻香芹酮、隐品酮4种紧张的苦味身分，末了采取对照品加入法结合苦味阈值干系性剖析验证其苦味。苦味身分分离、剖析、评价、验证过程见图2。
3 基于构造相似性的苦味身分创造策略
构造相似性是创造新身分或现有身分新活性的主要识别手段，通过对“模板”身分进行构造比拟，推测具有一定构造相似性的未知身分可能具有“模板”身分的相同或相似性子，构造上的差异性又导致该身分表现出不同于“模版”身分的性子。以黄连为例，其化学身分小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱的合成前体物都是苯丙氨酸，种别上均属于异喹啉类生物碱，构造中都含有异喹啉环、氮碱基，使其均具有相似的苦味[23]。但由于这几种生物碱在供氢体数量、可旋转键数量、相对分子质量、疏水性等构造参数上存在差异，苦味强度总体呈现出黄连碱＞表小檗碱＞小檗碱＞巴马汀＞药根碱[24]。
大量研究表明，苦味身分的苦味强度受到干系连接基团的影响。咖啡碱、柚皮苷、胆汁因含重氮基团而呈现苦味，生物碱的苦味强度受氮元素杂化状态影响[25]；无机盐因含锂、钙、铷、铯等碱金属离子可与某些身分络合从而产生苦味[26]；蛋白质、多肽、氨基酸因暴露的疏水性基团而呈现苦味[27]；酚类身分的苦味与相对分子质量有关[28]。此外，糖苷类、萜类身分的苦味与化学键有关，含硫苷键、氮苷键、氰苷键的苷类身分大多具有苦味，萜类身分因其内酯、内缩醛、内氢键、糖苷羟基等可形成螯合物而呈现苦味[29]。
综上，各种身分的苦味紧张与官能团、相对分子质量及化学键有关（表1）。BitterPredict是一个基于机器学习算法的苦味分类器，紧张以BitterDB数据库为苦味分子数据集，以现有文献中检索到的非苦味分子为非苦味分子数据集，在机器算法下通过化合物的化学构造预测其是否味苦，在一些外部测试集和感官验证中精确分类了70%～90%的化合物[32]。此外，BitterPredict在苦味分类过程中突出了总电荷、表面干系性子和毒性平分子性子作为区分苦味与非苦味的主要依据，为深入理解苦味分子的构造特色和呈味规律供应参考。基于构造相似性或苦味基团创造苦味身分的主要条件是化学构造已知，故此法多运用于构造已知身分的苦味判断。
4 基于苦味受体的苦味身分创造策略
苦味受体对苦味身分的识别浸染是判断化合物苦味的主要依据。苦味分子激活苦味受体，引起苦味细胞膜去极化、开释神经递质，旗子暗记传导至大脑皮层形成苦味的认知。苦味感知实际是苦味物质与苦味受体在结合位点的构造互补、能量互补。三点打仗理论是目前公认度最高的苦味身分构造理论，认为苦味化合物分子与苦味受体均应具有AH（亲电性基团）、B（亲核性基团）及X（疏水基团），个中，化合物AH与受体A′结合，化合物X与受体X′结合，而B′位置悬空，方能形成苦味[33]。基于苦味受体的识别浸染，梳理出分子对接、药效团模型等虚拟筛选方法，细胞膜色谱法、亲和超滤法等生物垂钓筛选方法[34]，及等温滴定量热法、钙离子测定等理化检测筛选方法（表2）。
分子对接和药效团模型基于苦味受体理论快速筛选潜在苦味身分，为苦味分子与苦味受体的结合浸染供应主要信息，赞助苦味身分的构造剖析；细胞膜色谱法和亲和超滤法基于苦味受体对苦味身分的识别浸染，利用苦味受体筛选中药稠浊组分中的苦味物质；等温滴定量热法丈量反应发生过程中的热量变革，检测苦味分子的存在，判断身分的苦味强弱；钙离子测定是苦味旗子暗记的间接表征，钙离子旗子暗记的强弱反响苦味身分的多少。相较于依据身分的构造相似性判别苦味，基于苦味受体对苦味分子的结合浸染，采取打算机虚拟筛选、生归天学检测方法，判别苦味身分与苦味受体的结合能、反应热、反应旗子暗记，利用超滤膜、生物柱色谱滤过筛选苦味身分，所得实验结果更具象，也更具说服力。
4.1 虚拟筛选4.1.1 分子对接分子对接是基于受体构造筛选配体分子的虚拟筛选方法，在中药活性身分筛选中发挥着重要浸染。分子对接法借助化合物数据库、对接软件对化合物分子和生物受体进行对接仿照，利用机器算法对对接结果进行评价[35]，以评价结果判断化合物分子与生物受体亲和力，以此筛选高亲和力的目标身分。对接过程紧张包括数据库选择化合物分子、化合物与受体三维构造转化、对接手法选择、对接结果评价等。
BitterDB是运用较多的公共苦味分子数据库，涵盖700多种苦味身分的名称、构造、能激活的苦味受体及苦味身分间的相似度[36]，为苦味分子对接供应了数据平台。韩彦琪等[37]利用同源建模、分子对接，初步推测延胡索中原小檗碱型化合物可能是其紧张的苦味身分。李轩豪等[38]采取分子对接技能，创造翼首草中的苦味身分紧张是8-表马钱苷酸、马钱苷酸等环烯醚萜苷类身分和新绿原酸、咖啡酸等酚酸类身分。须要把稳的是，分子对接结果的准确性紧张依赖于对接手法及评价打分，对接分数高不代表分子配体与生物受体结合浸染一定好，后续还需进行生物实验验证。
4.1.2 药效团模型药效理论认为相同活性的分子有构造相同的药效团。药效团模型在苦味身分筛选中发挥着重要浸染，是运用较多的虚拟筛选方法之一。该方法的重点是构建药效团模型和筛选候选物。构建药效团紧张内容包括天生数据集、构建药效团、验证药效团。目前已知人类的苦味受体有25种，不同苦味受体构造存在差异，任何一种苦味受体都无法识别所有的苦味分子。Meyerhof等[39]验证了人体内25个苦味受体与苦味身分间并非“一对一”识别，如范例的苦味身分——咖啡因[40]，可以同时被TAS2R7、10、43、46多个苦味受体识别，TAS2R39可以同时识别茶黄素和茶黄素-3,3′-O-双没食子酸酯[41]。
为提高筛选苦味身分成功率的同时减少事情量，一样平常选择具有苦味广谱性的TAS2R10、TAS2R14[42-43]、TAS2R46[39]受体来构建药效团模型。Zhang等[44]通过构建TAS2R14药效团模型，从柴胡紧张活性身分柴胡皂苷的3种亚型（柴胡皂苷a～c）中鉴定出柴胡皂苷b为TAS2R14的直接激动剂。Ke等[45]建立了TAS2R10、14、46受体的药效团模型，分别从黄连解毒汤中筛选出二氢木脂素A、黄芩黄酮II、黄柏酮等15或16种苦味身分。分子对接、药效团模型是运用最广泛的虚拟筛选方法，2种方法常在数据平台和打算机软件结合利用。此外，药效团模型与化学计量方法联用可用于推测苦味分子构象、打算配体与受体结合能量。
4.2 生物垂钓4.2.1 亲和超滤法亲和超滤法是一种基于生物受体亲和浸染筛选配体分子的方法[46]，与剖析方法联用可实现活性身分的快速筛选与识别。分离苦味受体细胞并培养，将其固定在超滤膜上来过滤筛选潜在的苦味物质（图3）。筛选苦味身分紧张有2部分：（1）亲和识别、滤过筛选苦味身分；（2）解析身分、验证活性。
在亲和识别身分中，需对亲和条件如苦味受体的用量进行稽核。若苦味受体过多，无亲和力或弱亲和力的身分可能会通过物理浸染与空缺受体结合，造成假阳性结果；倘若苦味受体过少，活性身分可能会因无靶标受体可结合而流失落，造成假阴性结果。在身分剖析部分，亲和超滤法常联用质谱技能或液质技能用于中药活性身分的筛选[46-47]。相较于传统的提取、分离、鉴定再活性验证的剖析方法，亲和超滤法在筛选苦味活性身分的同时，剔除了无苦味活性的身分，达到富集苦味身分的效果，有利于苦味身分的高效创造。
4.2.2 细胞膜色谱法
细胞膜色谱法是一种基于膜受体与配体分子亲和浸染识别、分离活性身分的生物色谱方法[48]。根据目标身分选用干系活性的细胞，可分离相应活性身分。在以苦味身分作为目标身分的细胞膜色谱法筛选实验中，将苦味细胞膜嵌合到色谱柱中作为固定相，含有潜在苦味身分的中药提取液流经色谱柱仿照服药后中药身分的体内过程，色谱柱可有效保留与苦味受体亲和程度高的药物分子，达到苦味受体亲和识别苦味身分和色谱柱分离苦味身分的双重浸染。
细胞膜存在活性周期，可能由于嵌合不稳固而脱落，影响筛选身分的效率。为提高细胞膜色谱柱的利用周期，常日会在传统细胞膜色谱法的根本上做出改进，如利用磁性纳米颗粒赞助稳定细胞膜[49]。细胞膜色谱法利用苦味细胞膜的特异性识别苦味身分，利用高效率的色谱柱分离苦味身分，有望为分离中药苦味身分供应一种生物垂钓结合化学分离的筛选方法。Tang等[50]将小鼠胚胎成纤维3t3-l1细胞与黄连粗提物共孵化，再结合高效液相色谱剖析技能，运用此法成功筛选出黄连中的小檗碱身分。
4.3 理化检测4.3.1 等温滴定量热法等温滴定量热法是基于化合物分子与生物蛋白相互浸染产生的微量热变革来识别身分，是一种通过物理检测识别生物反应来筛选苦味物质的方法[51]。分子间发生浸染会产生热量信息，测定反应过程的焓、熵、自由能等热力学参数、结合解离常数、结合常数等可推测反应物的化学计量比。此法还可直接丈量反应速率[52]，一定程度上反响化合物的浓度和活性。采取此法筛选苦味身分，打算机监测苦味受体结合苦味身分时的热量变革，以此表征是否存在苦味身分及其结合强弱（图4）。
Ogi等[53]采取等温滴定量热法检测苦味身分与脂肪酸发生浸染时的热量变革，创造热量变革强度与脂肪酸的碳链长度有关，为脂肪酸掩蔽苦味机制研究供应主要参考。柚皮素是一种苦味的类黄酮，与蛋白质形成复合物可有效粉饰苦味，Nunes等[54]采取等温滴定量热法表征柚皮素与乳铁蛋白1∶1复合物的热力学结合，结果表明该复合物的形成紧张由焓和熵驱动。相较于其他苦味身分筛选方法，该法无需固定或标记苦味受体，稳定性好、灵敏度高，可用于检测苦味身分的初步筛选。
4.3.2 钙离子测定法
钙离子是苦味受体上钙敏感体的内源性配体，可作为反响苦味身分激活苦味受体的主要旗子暗记[55]。苦味旗子暗记传导过程中会引起钙离子内流、内质网开释钙离子，苦味细胞内外钙离子浓度会发生显著变革。钙离子量化手段成熟，钙离子测定、钙离子成像[56]可以量化胞内钙离子变革。
Abbas等[57]通过钙成像反应，赞助啤酒花苦酸（matured hop bitter acids，MHBA）筛选能勾引MHBA刺激肠内分泌细胞产生胆囊紧缩素（cholecystokinin，CCK）的苦味受体，结果表明，人TAS2R1、8、10和小鼠TAS2R119、130、105有助于MHBA勾引肠内分泌细胞产生CCK。钙成像技能可以记录胞内钙离子的动态变革，钙离子荧光探针[58]可将受体细胞内的钙离子浓度变革通过旗子暗记转化以荧光的形式展现出来（图4）。虽然内质网上钙离子的流动、细胞膜上钙离子的进出并非仅由苦味冲动引发，但该法可用于潜在苦味身分的快速筛查。
5 结语与展望谱-效关联法利用数据剖析方法将指纹图谱与药效学信息关联，常运用于中药活性与身分关系研究和中药质量掌握[59]，为苦味身分创造供应了新思路——谱-味关联。谱-味关联以中药化学身分指纹图谱和口感评价为研究内容，以数据剖析方法为研究手段，构建谱-味数学模型，揭示身分-苦味的干系性。当代技能支撑下的中药化学指纹图谱、中药生物指纹图谱能全面反响苦味中药的整体组分和药效活性，灰色关联度剖析、多元线性回归剖析、主身分剖析等单一剖析方法利用或多种剖析方法联用等数据剖析方法将为苦味身分的筛选供应有力支撑。课题组以谱-味关联为研究思路，解析了12批不同来源三七水提液化学指纹图谱与苦味强度的干系性，创造了人参皂苷Rg1等3种紧张苦味身分[60]，为其他苦味身分的创造供应了方法参考。
本文根据中药苦味特点结合当下研究手段综述了中药苦味身分的创造策略，为从中药繁芜体系等分离剖析苦味身分供应了方法参考。本草学知识可通过文献性效记载、植物亲缘关系初步判断药物的整体苦味，减少苦味身分筛选的盲目性。传统分离手段逐步分离富集苦味身分，定性定量剖析手段可赞助实现苦味身分的精准辨识。利用苦味身分的构造相似性或特色性苦味基团，是创造苦味身分的主要路子。
基于苦味受体的识别浸染，发展出分子对接等虚拟筛选方法、亲和超滤等生物垂钓筛选方法、等温滴定量热等理化检测方法。基于数据挖掘和机器算法的发展，谱-味剖析法可为创造关键苦味身分供应参考方法。上述方法在挖掘苦味身分方面各有上风，但也存在一定局限性，多法联用可取长补短，提高苦味身分的创造几率，将成为未来中药苦味身分创造的主要思路。中药苦味身分的精准创造，对付深入理解中药的苦味呈味特色与机制具有理论价值，对开拓针对性的掩苦抑味方法具有现实意义。
